LRRK2-IN-1 CAS 1234480-84-2 Biologik faollik

Vitroda

Yovvoyi tipdagi va G2019S o'tkazuvchanligi 2,5 baravar yuqori TR-FRET signalini olib kelishi mumkin, bu esa uni inhibe qilishi mumkinLRRK2-IN-1dozaga bog'liq ravishda IC50 qiymatlari mos ravishda 0,08 mkM va 0.03 mkM [1]. LRRK2-IN-1 DCLK2 ni inhibe qilish uchun 45 nM IC50 ga ega va AURKB, CHEK2, MKNK2, MYLK, NUAK1 va PLK1 uchun biokimyoviy tahlillarda 1 mkm dan katta IC50 ni namoyish etadi. LRRK2-IN-1 MAPK7 ni EC50 160 nM ga inhibe qilganligi tasdiqlangan. LRRK2-IN-1, Ser910 va Ser935 fosforillanishining dozaga bog'liq bo'lgan inhibisyonini keltirib chiqaradi, bu yovvoyi tipdagi LRRK2 va LRRK2 [G2019S] ga H-3293 hujayralariga barqaror ravishda 14-3-3 ga ulanishi bilan birga keladi, bu esa HEK293 hujayralariga o'zgartiriladi [2]. LRRK2-IN-1, HepG2 hujayralarida 49,3 mkm IC50 bilan o'rtacha sitotoksikdir. LRRK2-IN-1 mos ravishda S9 bo'lsa va 15,6 va 3,9 mkm bo'lsa, genotoksiklikni namoyish etadi [3]. LRRK2-IN-1 ko'payishni, ko'chishni inhibe qiladi va HCT116 va AsPC-1 hujayralarining apoptozining belgilari bilan hujayralar o'limini keltirib chiqaradi [4] ..

Vivo shahrida

LRRK2-IN-1 (100 mg / kg, ip) sichqonlarning buyragida LRRK2 ning deposforlanishiga sabab bo'ladi [2]. LRRK2-IN-1 (100 mg / kg) peritumoral in'ektsiyasi o'simta hajmi va AsPC-1 o'simtasi ksenograflarining og'irligini sezilarli darajada pasayishiga olib keladi [4].

Kinase tahlil

Faol GST-LRRK2 (1326-2527), GST-LRRK2 [G2019S] (1326-2527), GST-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) va GST-LRRK2 [A2016T + G2019S] (1326-2527) ) tegishli ferment cDNA konstruktsiyalarining vaqtincha transfektsiyasidan so'ng, ferment HEK293 hujayra lizatidan 36 soat o'tgach glutatyon separoz bilan tozalanadi. Ikki nusxada bajarilgan peptid kinazasi tahlili 50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 0.1 mM da 0,5 mkg LRRK2 kinazini o'z ichiga olgan 40 mkl hajmda (taxminan 10% poklik 8 nM konsentratsiyasini beradi) o'rnatildi. EGTA, 10 mM MgCl2, 20 mkM Nikitid, 0,1 mkM [γ-32P] ATP (500 kub / soat / pmol) va ko'rsatilgan inhibitordagi kontsentratsiyasi DMSOda eriydi. 15 minut 30 ° C da inkubatsiyadan so'ng reaktsiyalar 35 mkL reaktsion aralashmani P81 fosfosellüloz qog'oziga tushirib, 50 mM fosfor kislotasiga botirish bilan to'xtatiladi. Namunalar juda ko'p yuviladi va [32-32P] ATP ni Nikitidga qo'shilishi Cerenkov tomonidan hisoblab chiqiladi. IC50 qiymatlari chiziqli bo'lmagan regressiya tahlilidan foydalanib, GrafPad Prizma yordamida hisoblanadi.

Hujayralarni tahlil qilish

Hujayralar (har bir quduqqa 104 ta hujayra) uch nusxada 96 quduqdan iborat to'qima madaniyati plitasiga urug'lanadi. Hujayralar LRRK2-IN-1 DMSO bilan 0, 0.31, 0.63, 1, 2 va 5, 10 va 20 mkm transport vositasi sifatida mavjud bo'lganda rivojlantiriladi. 48 soatdan keyin davolash, har bir quduqqa 10 mkl TACS MTT reaktivi qo'shiladi va hujayralar qorong'i kristalli cho'kma paydo bo'lguncha hujayralar 37 ° C da inkubatsiya qilinadi. DMSO-dagi 266 mM NH4OH dan 100 mL quduqqa qo'shiladi va 1 minut past tezlikda plastinka tebragichiga qo'yiladi. Chayqalgandan so'ng, plastinka nurdan himoyalangan 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilinishiga ruxsat beriladi va har bir quduq uchun OD550 mikroplider yordamida o'qiladi. Natijalar o'rtacha va DMSO (transport vositasi) boshqaruvining foizi sifatida hisoblanadi + / - o'rtacha qiymatning standart xatosi.

Hayvonlarni boshqarish

LRRK2-IN-1kaptisolda eritiladi va yovvoyi tipdagi C57BL / 6 sichqonlariga 100 mg / kg dozada qorin bo'shlig'iga in'ektsiya yo'li bilan yuboriladi. Tekshirish sichqonlariga Kaptisolning teng hajmi kiritiladi. 1 va 2 soatlik nuqtalarda sichqonlar bachadon bo'yni dislokatsiyasi va buyrak va miya to'qimalarining tez parchalanishi va suyuq azotning ichiga tushishi bilan o'chiriladi.

Adabiyotlar

[1]. Hermanson SB va boshqalar. LRRK2 Ser935 uchun fosforlanish.PLoS biri uchun yuqori o'tkazuvchanlikdagi TR-FRET uyali tahlilidan foydalangan holda yangi LRRK2 inhibitörleri uchun skrining. 2012; 7 (8): e43580. Epub 2012 yil 28-avgust.

[2]. Deng, Xianming. Va boshq. Parkinson' LRRK2 kinazining selektiv inhibitatorini tavsiflash. Tabiat kimyoviy biologiyasi (2011), 7 (4), 203-205.

[3]. Koshibu K va boshqalar. Parkinson&№ 39 kasalligini farmakologik tadqiqotlar uchun LRRK2-IN-1 ga alternativa. Farmakologiya. 2015; 96 (5-6): 240-7.

[4]. Weygant N va boshq. Kichik molekulali kinaz inhibitori LRRK2-IN-1 kolorektal va oshqozon osti bezi saratoniga qarshi dublokortinga o'xshash kinazni inhibe qilish orqali kuchli faollikni namoyish etadi 1. Mol saratoni. 2014 yil 6-may; 13: 103